高通量篩選案例：基于突變體文庫的無細(xì)胞表達(dá)篩選——phi29 DNA聚合酶

更新時間：2023-12-07 點(diǎn)擊次數(shù)：1077

摘要

酶是自然界重要的功能蛋白分子，其催化活性在基因編輯及干細(xì)胞技術(shù)、靶向藥物的生產(chǎn)、食品工業(yè)、紡織工業(yè)、醫(yī)學(xué)診斷、藥物制備等領(lǐng)域都有著重要的作用。本文中，我們以phi29 DNA聚合酶為代表，利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，搭建了高通量酶篩選平臺。結(jié)果顯示，在三天內(nèi)，我們就完成了96個phi29 DNA聚合酶突變體的表達(dá)，并對其活性進(jìn)行了檢測，找到了較為高效的phi29 DNA聚合酶突變體。

近幾年，隨著AI技術(shù)的進(jìn)步，AI輔助蛋白設(shè)計正在逐漸成為現(xiàn)實。在AI的設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)周期中，構(gòu)建和測試對AI的成長有著極大的作用。

一般傳統(tǒng)的蛋白表達(dá)流程為：

利用半理性的方式完成突變體基因的構(gòu)建后，將構(gòu)建的基因搭載至質(zhì)粒上，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)載體細(xì)胞內(nèi)。然后從涂布的平板上挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，隨后可以得到表達(dá)突變體蛋白的細(xì)胞株。通過細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)，之后裂解相應(yīng)細(xì)胞，即可得到含有目的突變蛋白的混合液。在此之后就可以進(jìn)行突變蛋白的純化和測試操作。該方法操作復(fù)雜且流程較長，如果目的突變蛋白對宿主細(xì)胞有毒害作用的話，可能會導(dǎo)致表達(dá)失敗。

對于這種高通量篩選來說，無細(xì)胞蛋白表達(dá)顯然是一種更有效的選擇。無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，利用裂解的生物體的生物質(zhì)，如核糖體、轉(zhuǎn)錄翻譯酶等成分，再加入合適的能量氨基酸等支持體系，即可在體外借助加入的模板DNA，實現(xiàn)快速高效的蛋白表達(dá)。無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可以有效地簡化蛋白表達(dá)的操作，使其更易于匹配高通量的應(yīng)用場景。同時其快速表達(dá)的特點(diǎn)，可以縮短蛋白表達(dá)的時間，有效縮短項目周期。

本文我們以phi29 DNA聚合酶為例子，利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，在三天內(nèi)高效表達(dá)出了96個蛋白酶突變體，并檢測其活性。揭示了無細(xì)胞技術(shù)在蛋白酶及藥物高通量篩選中的潛在應(yīng)用。

方法

突變引入及環(huán)化

我們選取了phi29DNA聚合酶的第221位和第350位氨基酸作為突變位點(diǎn)。先利用PCR的方式，將突變通過引物引入片段；再通過重疊PCR的方式整合突變片段。將整合好的目的基因片段和線性化的環(huán)狀片段通過seamless酶進(jìn)行連接，形成環(huán)化質(zhì)粒。

在此過程中，每次以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR之后，使用Dpn I 酶37℃消化1h以去除原始模板。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并涂板

取5μL引入突變的質(zhì)粒，加入到100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，置于冰上30min。接著，將上述感受態(tài)細(xì)胞置于42°C水浴中，熱激90秒后迅速放回冰浴中，靜置3~5min；再將其加入到500 ul不含抗生素的SOC或LB培養(yǎng)液中，輕輕混勻，37°C震蕩培養(yǎng)1h。隨后，通過離心菌液（5000 rpm ，1min）沉淀菌體，再將大部分培養(yǎng)液移除，剩余約50-100μL的培養(yǎng)液后重懸菌體，最后，全部均勻涂布到含卡那霉素的LB平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

挑取單克隆并保菌

向96孔板中加入100μL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，然后從LB培養(yǎng)板上挑取單克隆菌落加入96孔板中。再置于37℃的搖床中180rpm震蕩培養(yǎng)1h。

菌體PCR及高通量蛋白表達(dá)

從震蕩培養(yǎng)1h的96孔板的每個孔中取出1μL培養(yǎng)基，作為模板加入PCR體系。在經(jīng)過適當(dāng)?shù)腜CR程序后，取5μLPCR反應(yīng)體系，作為模板加入無細(xì)胞表達(dá)體系中。表達(dá)4個小時后，即可在體系中產(chǎn)生目的蛋白酶——phi29 DNA 聚合酶。

活性測定

Phi29 DNA聚合酶的活性測定是利用聚合酶活性來擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因的線性模板，通過最終產(chǎn)物綠色熒光的強(qiáng)度對phi29 DNA聚合酶的活性做出判斷。首先從最終的無細(xì)胞反應(yīng)體系中直接取出1μL的反應(yīng)上清液作為酶溶液加入到擴(kuò)增體系，該體系含有使phi29起效的緩沖液、綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒模板以及擴(kuò)增所需的引物。然后在42℃的條件下擴(kuò)增2h生成線性模板。最后取5μL的線性模板加入到終體積為50μL的無細(xì)胞反應(yīng)體系中，6小時后測定其熒光值，找出活性較強(qiáng)的phi29 DNA聚合酶突變體。

結(jié)果

活性結(jié)果

在激發(fā)波長485nm發(fā)射波長535nm的條件下，測定綠色熒光蛋白的熒光值。不同孔中的熒光值有明顯的不同，表明不同phi29 DNA聚合酶的突變體有不同的活性強(qiáng)度。

突變測序

測定活性之后，從之前保存的96孔培養(yǎng)板上取活性強(qiáng)度較高的幾個孔位所對應(yīng)的菌體，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行測序操作。我們成功找到了在此板上活性強(qiáng)度的phi29 DNA聚合酶突變體。其在221位和350位的氨基酸組合如下所示。

活性排名	221	350
1	苯丙氨酸	苯丙氨酸
2	苯丙氨酸	酪氨酸
3	異亮氨酸	蘇氨酸

結(jié)論

通過上述實驗，珀羅汀生物展示了一種運(yùn)用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，高通量篩選并驗證突變蛋白的方法。該方法在3天內(nèi)完成了近百種突變蛋白的構(gòu)建表達(dá)及活性驗證，顯著縮短了蛋白篩選的時間，減少了人工操作成本，提高了研發(fā)效率。

蛋白質(zhì)生物活性和穩(wěn)定性的不斷提升，對于蛋白類產(chǎn)品在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、造紙、紡織、生物能源、家庭護(hù)理等方面推廣應(yīng)用，有著舉足輕重的作用。運(yùn)用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，能夠更高效快速地完成蛋白質(zhì)改造與篩選，縮短酶制劑、蛋白藥物等各類蛋白產(chǎn)品的研發(fā)周期，降低研發(fā)成本，從而促進(jìn)新型重組蛋白、酶、抗體等蛋白產(chǎn)品的快速發(fā)展。

珀羅汀生物作為一家專業(yè)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)生物技術(shù)公司，將繼續(xù)利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)優(yōu)勢，開發(fā)更為廣泛的應(yīng)用場景。