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頂刊力薦!無細(xì)胞體系下的膜蛋白合成新突破

更新時間:2024-08-01      點擊次數(shù):310

膜蛋白幾乎在所有生理過程中都起著重要作用,這些作用包括但不限于細(xì)胞間接觸、表面識別、酶活性或跨膜運(yùn)輸?shù)取Dさ鞍鬃鳛樯锬すδ艿闹饕袚?dān)者,其對于維持細(xì)胞乃至生物體的正常生理功能至關(guān)重要。據(jù)統(tǒng)計,約50%藥物的靶向分子為膜蛋白,特別是跨膜蛋白,它們占據(jù)了已知藥物靶點的很大比例。膜蛋白研究不僅有助于揭示疾病的發(fā)生機(jī)制,還能推動生物學(xué)研究的深入。此外,研究人員還可以設(shè)計出具有特定功能的膜蛋白或基于膜蛋白的生物材料。這些新材料在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。因此,膜蛋白的研究至關(guān)重要。

然而,目前膜蛋白研究依舊面臨著困境。首先在生物體內(nèi)膜蛋白的表達(dá)量較低,其次,因膜蛋白自身具有高度疏水性,因此它在溶液中很容易形成聚集體,另外膜蛋白可能包含多個跨膜區(qū)域,糖基化修飾等等,且它在常規(guī)條件下難以維持正確的構(gòu)象。

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研究背景


傳統(tǒng)的基于細(xì)胞的膜蛋白表達(dá)通常會存在問題,比如:低產(chǎn)、細(xì)胞毒性、蛋白質(zhì)聚集以及錯誤折疊等。而膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究也因為難以生產(chǎn)足夠數(shù)量的蛋白質(zhì)產(chǎn)品而受到嚴(yán)重阻礙。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)(CFPS)系統(tǒng)正被視為克服上述障礙的可行替代工具,因為在CFPS系統(tǒng)中幾乎不需要考慮細(xì)胞活力和蛋白表達(dá)過程,此外,該系統(tǒng)的開放性允許研究人員直接控制反應(yīng)條件,例如,添加輔助試劑,各種形式的脂質(zhì)、催化劑等等。


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圖1:當(dāng)前膜蛋白的CFPS策略


去垢劑存在下的CFPS


相比于傳統(tǒng)的基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)來說,CFPS系統(tǒng)由于其與細(xì)胞活性解耦的特性,提供了一種更加快速高效的蛋白質(zhì)合成方案。而去垢劑在此過程中起到了關(guān)鍵作用,通過溶解膜蛋白并防止其聚集,從而去提高膜蛋白的可溶性和表達(dá)效率。

已有研究討論了去垢劑對體外表達(dá)的膜蛋白的影響,那些在產(chǎn)量和溶解度方面都成功的實驗是使用臨界膠束濃度(CMC)相對較低的溫和去垢劑,而為了防止聚集體或不均勻的蛋白質(zhì)聚合物的形成,表達(dá)的蛋白質(zhì)和膠束之間的摩爾比不得高于1。通常是不建議使用具有相對高CMC的去垢劑,因為它們必須以相當(dāng)高的濃度存在,因此會抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯。


重組或直接插入囊泡和脂質(zhì)體


體外膜蛋白重建的理想情況是在更類似于天然脂質(zhì)雙分子層的環(huán)境中工作。將膜蛋白重新構(gòu)建或直接插入到囊泡和脂質(zhì)體中,是CFPS系統(tǒng)中一種重要的策略,這有助于研究膜蛋白的功能和結(jié)構(gòu)。其中重新構(gòu)建策略有兩種,包括從沉淀物中重新構(gòu)建以及利用吸附劑顆粒。直接插入的策略也有兩種,包括在無細(xì)胞表達(dá)反應(yīng)中直接加入脂質(zhì)體(如DOPC、DMPC等)以及利用倒轉(zhuǎn)囊泡的方法。

通過重新構(gòu)建或直接插入囊泡和脂質(zhì)體的方法來實現(xiàn)更接近膜蛋白的天然環(huán)境,這將有助于保持膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,適用于功能研究和藥物傳遞等。然而脂質(zhì)體和囊泡的異質(zhì)性可能會影響結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,且高質(zhì)量的倒轉(zhuǎn)囊泡樣本難以制備,商業(yè)上也不易獲得。


使用納米脂蛋白顆粒(NLPs)


為了克服使用微粒體和囊泡的局限性,最近提出了基于使用“納米生物"或“納米脂蛋白顆粒"(NLP)的新策略。它是一種納米級的盤狀顆粒,由兩親性螺旋蛋白(即支架蛋白)包裹在脂質(zhì)雙分子層的平面圓周上形成。NLPs的直徑取決于所使用的支架蛋白類型,通常在9~20納米之間,且分子質(zhì)量偏差非常小(<5%),這使得它們具有高度的單分散性。這種結(jié)構(gòu)為膜蛋白的表達(dá)和研究提供了理想的平臺。

NLPs通過其的結(jié)構(gòu),能夠穩(wěn)定地包裹和呈現(xiàn)膜蛋白,有助于保持其天然構(gòu)象和功能。與微粒體和囊泡等傳統(tǒng)載體相比,NLPs具有更高的穩(wěn)定性和可控性,從而顯著提高了膜蛋白的表達(dá)效率和純度。此外,NLPs還具有高度的可定制性,可以通過選擇不同的支架蛋白(如載脂蛋白A1、E和C,以及昆蟲的脂磷蛋白等)來適應(yīng)不同類型的膜蛋白需求。


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圖2:NLP存在下的無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)


未來展望


1. 結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的挑戰(zhàn)與機(jī)遇

盡管CFPS技術(shù)在研究膜蛋白方面已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展,部分膜蛋白結(jié)構(gòu)已通過X射線晶體學(xué)和固態(tài)核磁共振(NMR)技術(shù)得到解析,但在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域仍面臨重大挑戰(zhàn)。未來,需要更多地探索CFPS技術(shù)與結(jié)晶技術(shù)(如脂質(zhì)立方相結(jié)晶)之間的協(xié)同效應(yīng),比如使用NLP(納米脂質(zhì)顆粒)-蛋白質(zhì)復(fù)合物而非去垢劑溶解的蛋白質(zhì)來填充立方相基質(zhì),以期提高結(jié)構(gòu)解析的成功率和質(zhì)量。


2.多樣化表達(dá)策略


CFPS膜蛋白在產(chǎn)量、溶解度和蛋白質(zhì)質(zhì)量方面取得了顯著改進(jìn)。未來,這一領(lǐng)域的研究將繼續(xù)聚焦于優(yōu)化反應(yīng)條件,以較大化膜蛋白的產(chǎn)量,并改善其溶解性和功能活性,從而推動下游應(yīng)用的發(fā)展。無細(xì)胞表達(dá)膜蛋白的策略多種多樣,包括在去垢劑存在下的表達(dá)、作為沉淀表達(dá)、在脂質(zhì)體或囊泡存在下的表達(dá)、使用NLPs的表達(dá),以及與支架蛋白的共表達(dá)等等。每種策略都有其優(yōu)勢和局限性。未來的研究將進(jìn)一步開發(fā)和優(yōu)化這些策略,以適應(yīng)不同類型的膜蛋白和研究需求。


3.跨學(xué)科合作與技術(shù)創(chuàng)新


膜蛋白研究的復(fù)雜性要求跨學(xué)科的合作,包括生物化學(xué)、分子生物學(xué)、物理學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域。未來的研究將借助高通量篩選、機(jī)器學(xué)習(xí)等新技術(shù),加速新方法的開發(fā)和應(yīng)用,以提高無細(xì)胞表達(dá)膜蛋白的效率和成功率。

隨著無細(xì)胞表達(dá)膜蛋白技術(shù)的不斷成熟,其應(yīng)用前景也將更加廣闊。在藥物研發(fā)、生物傳感器、生物能源、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域,膜蛋白都展現(xiàn)出巨大的潛力。未來,將更多地探索這些潛在應(yīng)用,推動相關(guān)技術(shù)的轉(zhuǎn)化和商業(yè)化。


參考文獻(xiàn):

Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023;48(7):642-654. doi:10.1016/j.tibs.2023.03.006




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