無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)是一種先進(jìn)的體外重組蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)，是利用含有蛋白質(zhì)合成必需組分的細(xì)胞裂解物，在體外條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的過(guò)程。這些必需組分通常包括核糖體、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、氨酰合成酶、啟動(dòng)/延伸/終止因子、三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）、ATP、Mg2+和K+等。該技術(shù)通過(guò)在體外模擬細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了不依賴于完整細(xì)胞體系的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。
一、模板DNA方面
純度要求
模板DNA的純度對(duì)無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)至關(guān)重要。如果模板DNA含有雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、RNA、有機(jī)溶劑等，可能會(huì)干擾無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)的反應(yīng)過(guò)程。例如，殘留的蛋白質(zhì)可能會(huì)與無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的酶競(jìng)爭(zhēng)底物，或者影響酶的活性。一般要求模板DNA的純度達(dá)到較高的標(biāo)準(zhǔn)，A260/A280比值通常在1.8-2.0之間，以確保模板DNA的質(zhì)量。
需要通過(guò)合適的純化方法，如酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等，去除雜質(zhì)，以獲得高質(zhì)量的模板DNA用于后續(xù)的無(wú)細(xì)胞表達(dá)。
濃度優(yōu)化
模板DNA的濃度需要合理調(diào)整。濃度過(guò)低可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量低，因?yàn)閰⑴c翻譯的模板數(shù)量有限；而濃度過(guò)高則可能會(huì)引起模板之間的相互干擾，或者使反應(yīng)體系的黏度增加，影響物質(zhì)的擴(kuò)散和反應(yīng)效率。
不同的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對(duì)模板DNA的優(yōu)濃度要求不同，一般需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。例如，對(duì)于某些基于大腸桿菌裂解物的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，模板DNA的濃度可能在50-200 ng/μL之間較為合適。
二、原料供應(yīng)方面
氨基酸供應(yīng)
確保無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中有足夠且平衡的各種氨基酸是關(guān)鍵。缺乏任何一種必需氨基酸都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成不完整或產(chǎn)量降低。
有些特殊的氨基酸，如硒代半胱氨酸，在某些蛋白質(zhì)的合成中是必需的，但在常規(guī)的氨基酸混合物中可能不存在，這時(shí)需要另外添加。同時(shí)，氨基酸的濃度也會(huì)影響蛋白質(zhì)表達(dá)，過(guò)高的氨基酸濃度可能會(huì)抑制反應(yīng)，因此需要根據(jù)具體的表達(dá)系統(tǒng)和蛋白質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化。
能量物質(zhì)供應(yīng)
無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)需要能量物質(zhì)來(lái)驅(qū)動(dòng)反應(yīng)，通常是三磷酸腺苷（ATP）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。ATP為蛋白質(zhì)合成提供能量，包括肽鍵的形成、氨基酸的激活等過(guò)程都需要ATP參與。NADPH主要參與一些需要還原環(huán)境的步驟，如二硫鍵的形成等。
這些能量物質(zhì)的濃度需要維持在合適的水平。如果ATP濃度過(guò)低，蛋白質(zhì)合成會(huì)因?yàn)槟芰坎蛔愣茏瑁蝗绻麧舛冗^(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)的滲透壓改變，影響反應(yīng)的正常進(jìn)行。一般會(huì)根據(jù)無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的特性和反應(yīng)規(guī)模來(lái)確定能量物質(zhì)的添加量。
三、反應(yīng)條件控制方面
溫度控制
溫度對(duì)無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)中的酶活性有顯著影響。不同的酶在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中有其最適反應(yīng)溫度。一般來(lái)說(shuō)，無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的反應(yīng)溫度在室溫（20-25°C）到37°C之間。溫度過(guò)低，酶的活性會(huì)降低，蛋白質(zhì)合成速度變慢；溫度過(guò)高則可能導(dǎo)致酶變性失活。
例如，對(duì)于一些來(lái)源于大腸桿菌的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，37°C可能是比較合適的溫度，但這個(gè)溫度也可能會(huì)加速系統(tǒng)的蒸發(fā)和成分的降解，所以需要在反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)合適的設(shè)備（如恒溫水浴、金屬加熱塊等）精確控制溫度。
pH值控制
pH值會(huì)影響蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)和酶的活性。無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)通常有一個(gè)最適pH范圍，一般在7.0-8.5之間。不適當(dāng)?shù)膒H值可能會(huì)導(dǎo)致氨基酸的離子化狀態(tài)改變，影響翻譯過(guò)程中的氨基酸活化和肽鏈延伸。
同時(shí)，pH值的變化還會(huì)影響無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中各種酶的活性，例如，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶在不適當(dāng)?shù)膒H條件下可能無(wú)法正常發(fā)揮功能。可以通過(guò)添加緩沖液（如Tris-HCl、HEPES等）來(lái)維持反應(yīng)體系的pH穩(wěn)定。
離子強(qiáng)度控制
離子強(qiáng)度對(duì)無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)也有重要影響。合適的離子強(qiáng)度可以維持蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，促進(jìn)酶與底物的結(jié)合。
過(guò)高的離子強(qiáng)度可能會(huì)屏蔽分子間的電荷相互作用，干擾反應(yīng)；過(guò)低的離子強(qiáng)度則可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)和核酸的聚集或沉淀。通常通過(guò)添加適量的鹽（如氯h鉀、氯化鈉等）來(lái)調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，使其適應(yīng)無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的要求。
四、抑制因素方面
內(nèi)源核酸酶抑制
無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中可能存在內(nèi)源核酸酶，這些核酸酶會(huì)降解模板DNA和mRNA，從而降低蛋白質(zhì)表達(dá)的效率。為了防止這種情況，需要添加核酸酶抑制劑，如RNasin（用于抑制RNA酶）和某種DNA酶抑制劑。
不同的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)可能需要不同類型和濃度的核酸酶抑制劑。例如，在一些植物無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，由于植物組織本身含有較多的RNA酶，可能需要添加較高濃度的RNasin來(lái)有效抑制RNA降解。
蛋白酶抑制
無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中也可能含有蛋白酶，這些蛋白酶會(huì)降解新合成的蛋白質(zhì)。添加蛋白酶抑制劑（如苯j(luò)基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）等）可以保護(hù)目標(biāo)蛋白質(zhì)不被降解。
但是，蛋白酶抑制劑的使用需要謹(jǐn)慎，因?yàn)槟承┮种苿┛赡軙?huì)對(duì)無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的酶產(chǎn)生非特異性抑制。在選擇蛋白酶抑制劑時(shí)，需要考慮其特異性和對(duì)無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的兼容性。
掃一掃，關(guān)注微信